Caracterização da microbiota NSLAB

Os principais grupos de bactérias que caracterizam as NSLAB são Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Enterococcus. Esta microbiota é essencialmente descontrolada, podendo se desenvolver em amplas faixas de pH e temperatura, e a predominância de algumas espécies em detrimento de outras é determinada pela capacidade de utilização dos substratos disponíveis, sendo eles: metabolização da lactose e/ou citrato de cálcio; além da racemização da molécula de lactato.

As atividades proteolíticas do grupo de Lactobacillus podem contribuir para o acúmulo de peptídeos amargos que resultam em “off flavour”, além de defeitos de textura como a formação de gás. Estas bactérias também são capazes de formar biofilmes nos equipamentos, sobrevivendo aos efeitos de sanitizantes e sistemas de CIP (“cleaning in place”). Algumas cepas podem impactar na descoloração do produto sob condições anaeróbias convencionais, anaeróbias facultativas e aeróbias; contudo, o grau de descoloração depende de vários fatores, como a natureza do corante e estabilidade em relação às variações de temperatura e concentrações de oxigênio.

Do grupo das NSLAB, o Leuconostoc é uma das mais importantes bactérias produtoras de gás. Algumas cepas de Leuconostoc produzem gás, diacetil, acetato e acetoína por meio da metabolização do citrato. Entretanto, os Pediococcus também são capazes de produzir acetato e CO₂ a partir do lactato na presença de O₂ e, também, podem impactar na alteração de sabor dos iogurtes.

Já os Enterococcus, ocorrem amplamente nos ambientes, mas são associados principalmente ao trato intestinal e sua presença em leites fermentados é frequentemente associada a má higienização. Estas cepas têm elevada probabilidade de sobreviver ao processo de pasteurização e podem metabolizar o citrato formando acetaldeído, acetoína, diacetil e CO₂. Podem apresentar atividades lipolíticas e proteolíticas que irão impactar na estrutura da coalhada formada durante a fermentação, causando desestabilização da base láctea, perda de textura e aumento da sinérese.

Importância da higienização do processo produtivo

Além do leite e demais matérias-primas, a manutenção da qualidade do iogurte é regida por uma multiplicidade de fatores inter-relacionados, como a limpeza das superfícies que entram em contato com o produto, equipamentos do processo, máquinas de envase e materiais de embalagem.

Após o processamento do leite e derivados, os equipamentos passam a apresentar resíduos de alto valor nutritivo, como carboidratos, gorduras, proteínas e minerais. Esse aumento na carga de matéria orgânica durante o ciclo de processamento é passível de multiplicação microbiana, pois fornece os nutrientes necessários para o crescimento dos microrganismos remanescentes nos equipamentos.

Quanto maior o ciclo de produção, maior será a carga de resíduos, podendo levar à formação de biofilmes que dificultam a limpeza devido à adesão dos constituintes do leite. O biofilme tem potencial para agir como fonte de contaminação microbiana crônica, que pode comprometer a qualidade dos produtos. Eles são representados por populações de bactérias aderentes umas às outras e/ou à superfícies, sendo capazes de formar micro ou macro colônias nos equipamentos.

Com isso, é importante que o CIP seja realizado de forma eficiente, garantindo a remoção de sujidades para melhor controle da proliferação de contaminantes.

Métodos de detecção

O controle da contaminação por NSLAB é de grande relevância, considerando os elevados impactos na qualidade dos iogurtes, nos custos de operação da indústria, bem como na segurança e confiança do consumidor.

Para detecção microbiológica são conhecidas as dificuldades na determinação de micro colônias e a incapacidade da identificação de linhagens selvagens de NSLAB pelos métodos fenótipos. Porém, é possível identificar a presença da microbiota por meio da análise de contagem total de NSLAB e da contagem de bactérias fermentadoras de citrato.

Para a determinação de NSLAB total utiliza-se o meio de cultura MRS e/ou M17 + Vancomicina, resultando no crescimento de colônias, em sua maior parte, compostas por grande variedade de bactérias do grupo bacilos, no qual não é possível distinguí-las e identificá-las devido à elevada diversidade de cepas. Portanto, para produtos que utilizam cultivos mesofílicos em sua composição não é indicada a aplicação desta metodologia, pois o resultado encontrado pode ser falso-positivo.

O método de contagem total baseia-se na premissa de que o iogurte é composto, obrigatoriamente, pelas bactérias termofílicas S. thermophillus e L. bulgaricus, que não se multiplicam a 22 °C. Portanto, se o produto não apresenta em sua composição a adição de bactérias mesofílicas adjuntas, o crescimento resultante pode ser relacionado com o crescimento da microbiota contaminante NSLAB.

Já para a determinação de bactérias fermentadoras de citrato, deve-se considerar o uso do meio de cultura ágar Leesment, enriquecido com componentes como citrato de cálcio e carboximetilcelulose utilizados como substratos, favorecendo assim o crescimento deste grupo de bactérias. Na leitura desta análise pode-se encontrar bactérias da família das enterobactérias, Pediococcus, Leuconotoc e, também, bactérias do grupo dos bacilos produtoras de gás, como, por exemplo, Lactobacillus plantarum.

Outra forma de detectar a contaminação por NSLAB no processo produtivo de iogurtes é por meio da avaliação de eficiência de limpeza CIP nas etapas do processo que compreendem a pasteurização, linhas de transferência e tanques de fermentação. Este método identifica pontos críticos de contaminação onde ocorre o aumento da carga celular contaminante, favorecendo a recontaminação do leite. Considerando que todas as bactérias pertencentes a microbiota NSLAB são bactérias ácido láticas, ou seja, produtoras de ácido lático, o método baseia-se na leitura comparativa de deslocamento de pH das amostras coletadas durante o processo e incubadas à temperatura de fermentação. Fixando-se o mesmo delta de deslocamento de pH, pode-se concluir que quanto maior for a carga celular contaminante, menor será o tempo de acidificação e, consequentemente, menor deverá ser o intervalo entre CIP.

Ambas vias analíticas são eficientes e complementares para detecção e controle da microbiota NSLAB, sendo possível correlacionar o nível de contaminação com os desvios de qualidade nos iogurtes citados inicialmente.

Para a detecção de biofilmes, a análise de superfície (SWAB) após a sanitização das linhas em diferentes pontos de coleta, principalmente em locais de difícil acesso, também é uma eficiente forma de identificar os pontos críticos de contaminação.

Controle da microbiota NSLAB

Associadas ao controle de qualidade do leite e eficiência de limpeza nas linhas de processamento de iogurte, algumas práticas adotadas no processo podem contribuir para manter baixos os níveis de contaminação por NSLAB.

Elevados intervalos de estocagem da base láctea no tanque de mistura podem impactar na proliferação bacteriana, considerando que a pasteurização do leite cru no recebimento não é eficiente para eliminar grande parte das bactérias que compõem este grupo. Sabemos que a pasteurização reduz de forma logarítmica a carga bacteriana contida no leite. Desta forma, quanto maior for a carga contaminante da mistura a ser processada, maior a probabilidade do produto carrear altos níveis de contaminação.

A concentração de inóculo do cultivo adicionado contribui significativamente para proteger o produto contra a proliferação de microrganismos indesejáveis, pois quando se utiliza a dosagem nominal (indicada) do cultivo, maior será a carga celular de Streptococcus thermophillus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e, com isso, menor será a fase LAG, prevenindo o crescimento de contaminantes. Na cinética de acidificação, a fase LAG representa a fase de latência do cultivo, ou seja, o cultivo ainda não iniciou seu processo de multiplicação. Neste intervalo, as condições são ideais para a proliferação de contaminantes, pois além de não haver competição devido à fase de adaptação do cultivo, oferece condições ótimas tanto em relação à temperatura quanto à oferta de substratos. Em outras palavras, quando “esticamos” a dosagem do cultivo adicionado para fermentação, menor será a carga celular e maior será o intervalo da fase LAG e maior será a probabilidade de desenvolvimento de contaminantes.

Outra prática que pode ser adotada é resfriar o produto logo após ele atingir o pH de corte na etapa de fermentação, uma vez que, o resfriamento rápido contribui para frear o crescimento de bactérias contaminantes. Além disso, de forma alternativa, porém de maior impacto em investimento, tecnologias de microfiltração e bactofugação podem ser empregadas no processo a fim de remover microrganismos indesejáveis.

O controle da microbiota contaminante NSLAB em iogurtes contribui para a redução do desperdício de alimentos e geração de resíduos decorrentes do descarte de produtos, além de reduzir os impactos financeiros gerados por problemas de desvios de qualidade e, consequentemente, gerar maior satisfação e fidelização do consumidor.

Como a gordura está presente no leite?

O leite bovino contém entre 3 e 5% de gordura em forma de emulsão, formada por pequenos glóbulos com tamanho médio de 3 a 4 μm, estabilizados por uma membrana muito fina. Existem cerca de 15 bilhões de glóbulos de gordura por mililitro de leite, podendo variar dependendo da raça, estágio de lactação e dieta do animal. A gordura do leite é predominantemente formada por triglicerídeos que representam, aproximadamente, 98% da fração lipídica total e os 2% restantes são compostos por monoglicerídeos e diglicerídeos, ácidos graxos, fosfolípides, esteróis e vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K).

O triglicerídeo é a combinação de uma molécula de glicerol mais 3 ácidos graxos, ou seja, cada glicerol liga-se a três moléculas de ácidos graxos; porém, existem diferentes combinações de ácidos graxos em um único triglicerídeo devido à grande variedade deste componente no leite.

Composição da membrana do glóbulo de gordura

A membrana que envolve o glóbulo de gordura é composta principalmente por fosfolipídeos e proteínas (ver figura na página 3). Apresenta funções importantes e atua como uma barreira entre a fase aquosa do leite e os triglicerídeos, que são hidrofóbicos e não possuem afinidade com a água, assim como, isola e protege os glóbulos contra a ação de enzimas (Lipases).

A estabilidade da membrana do glóbulo de gordura é diretamente afetada pelo pH do leite. À medida que o pH do leite cai, aumenta a sensibilidade à ruptura desta camada protetora. Se a membrana for fisicamente danificada por alto cisalhamento, ocorrerá a liberação da gordura presente dentro do glóbulo, conhecida como gordura livre. Durante a fabricação de queijos a gordura livre não será incorporada à coalhada; dessa forma, aproximadamente 10% dessa gordura será perdida no soro, afetando diretamente a taxa de recuperação e, consequentemente, o rendimento.

Perdas de gordura na fabricação de queijos

Medir o percentual de recuperação de gordura na fabricação de queijos auxilia a entender a eficiência do processo. Sabemos que a gordura tem grande impacto nas propriedades reológicas e sensoriais, mesmo sem exercer nenhum papel ativo na etapa de coagulação, ou seja, melhorar a taxa de recuperação está diretamente relacionada à integridade e ao tamanho dos glóbulos de gordura, às características físicas da rede proteica, à eficiência no momento do corte e a ação termomecânica aplicada durante o processo.

Devido à alta valorização da matéria gorda no mercado, otimizar a recuperação de gordura no queijo se torna uma grande oportunidade na busca de maior eficiência produtiva e aumento da rentabilidade. Dependendo da composição do leite e tecnologia empregada, 85 a 95% da gordura do leite será retida na coalhada e o restante perdido no soro. Na produção de queijo muçarela, por exemplo, a taxa de recuperação de gordura raramente ultrapassa 90% devido às perdas adicionais encontradas no processo de filagem. Por meio de fórmulas específicas é possível medir a taxa de recuperação de gordura, identificando o percentual que foi transferido do leite para o queijo, assim como, a quantidade em gramas de gordura que foram necessárias para produzir 1kg de queijo. Visando mensurar e interpretar os dados obtidos no processo, podemos correlacionar os cálculos para identificar como aumentar a eficiência produtiva, pois quanto melhor a taxa de
recuperação, menos gordura será perdida no soro e menor será a quantidade necessária de gordura para fabricar 1 kg de queijo.

Recuperação de gordura

Várias técnicas foram desenvolvidas para aumentar a recuperação de sólidos e o rendimento em queijos, desde a otimização dos equipamentos utilizados no processo até tecnologias envolvendo a concentração do leite por meio de micro ou ultrafiltração. Geralmente são tecnologias que envolvem maior custo de investimento, um complicador para a maioria dos fabricantes.

A homogeneização é um método muito utilizado nos processos produtivos de diversos produtos lácteos afim de estabilizar a emulsão, causando redução do tamanho e ruptura dos glóbulos de gordura. Os novos glóbulos formados são envolvidos em parte por uma mistura de proteínas, sendo a caseína a principal fração. A nova conformação da membrana facilita a interação entre a gordura e a rede proteica formada durante a coagulação, retendo mais gordura na coalhada (Ver gráfico ao lado). Na fabricação, exceto para grupos específicos de queijos, não é comum a prática de homogeneização, pois, além da necessidade de investimento, o leite homogeneizado forma um coágulo com menor tendência à sinérese, impactando no aumento do teor de umidade que gera elevada atividade de água e acelera as reações bioquímicas que causarão o amolecimento e alterações sensoriais do queijo. A ruptura da membrana do glóbulo de gordura favorece a ação de lipases promovendo a lipólise, não desejada para a maioria dos tipos de queijos.

Os queijos macios (soft cheese) com maturação na superfície têm uma definição simples: eles amadurecem da casca para seu interior, por meio de bactérias, leveduras e/ou bolores que são comumente inoculados ao leite no início da fabricação, ou pulverizados na superfície dos queijos após a salga. No caso específico dos queijos azuis, eles são perfurados após a salga para facilitar a aeração interior e estimular o crescimento do mofo. No decorrer da maturação, e sob condições especiais de temperatura e umidade relativa, o fungo se desenvolve, tornando-se o principal responsável pela evolução da proteólise e o surgimento do sabor desejado nos queijos. Esta edição do Ha-La Biotec apresenta uma revisão das principais características dos cultivos recomendados para esta linha especial de queijos macios com maturação aeróbica.

Soluções Chr. Hansen

Mofo branco

O brilho e a espessura da camada superficial do queijo com mofo branco podem ser a marca registrada para o reconhecimento e benchmarking do consumidor. A escolha do mofo branco utilizado terá um papel importante no sabor, no tempo de lançamento no mercado e na vida útil.

Penicillium candidum

Penicillium candidum (camemberti) é utilizado para a fabricação de queijos maturados com mofo branco, como o Camembert e o Brie. As cepas possuem cor branca e são caracterizadas pela densidade de crescimento e altura do micélio na superfície do queijo, propriedades proteolíticas e lipolíticas, e resultante formação de sabor suave a aromático. As diferentes cepas são capazes de liberar compostos aromáticos específicos, como 2-metil-1-propanol, 3-metil-1-butanol, ácido 2-metil-butírico, metil-cetonas e álcoois secundários. Para alguns queijos (coalhada de fermentação lática e queijos de cabra), estão disponíveis estirpes com micélio cinzento-azulado (nome comercial P. camemberti).

Geotrichum candidum

As culturas de G. candidum também são frequentemente utilizadas para queijos maturados com mofos. G. candidum previne o crescimento de P. roqueforti e o crescimento excessivo de P. camemberti na superfície do queijo resultando um micélio mais uniforme quando usado para queijos mofados. Estão disponíveis cepas especiais com propriedades anti-mucor ou anti-amargor.

As cepas de G. candidum podem desenvolver características semelhantes a leveduras ou mofo e também são usadas para a maturação de queijos de crosta lavada, especialmente queijos macios. As cepas de G. candidum são caracterizadas por atividades proteinase, amino-peptidase e lipolíticas com capacidade de desenvolver compostos aromáticos típicos (metil-cetonas, álcoois secundários, dimetil-sulfeto e fenil-etanol).

Com esse potencial metabólico variado pode-se dizer que o G. candidum desempenha um papel importante na maturação de muitos queijos macios e semiduros, resultando numa contribuição positiva para o desenvolvimento do sabor e do aroma – (quando usado isolado ou em combinação com outros cultivos de mofos para maturação).

Penicillium roqueforti

As cepas de Penicillium roqueforti com aparência verde a azul-esverdeada são utilizadas para queijos de veia azul, como Bavaria Blue, Gorgonzola, Roquefort, Bleu d´Auvergne, Stilton, Danablu e Petit Bleu. Além da aparência, as cepas de P. roqueforti são escolhidas pela velocidade de crescimento e pelas diferenças nas atividades proteolíticas e lipolíticas.

O desenvolvimento do aro-ma varia de suave a muito picante. A hidrólise da gordura em mono e diacilgliceróis e ácidos graxos, e a subsequente produção de metil-cetonas através da β-oxidação dos ácidos graxos, são as principais atividades bioquímicas dos fungos no queijo azul. Os ácidos butírico (C4) e capróico (C6) e 2-heptanona são os principais compostos responsáveis pelo sabor forte e picante dos queijos azuis.